薄层色谱法要点

发布者:admin 发布时间:2019-10-27 13:34 浏览次数:

  什么是TLC? 薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC) 是将适宜的固定相喷涂(或喷雾)于玻璃板, 塑料或铝基片上,成一均匀薄层。干燥后 进行点样,展开,斑点定位;或与适宜的 对照物随行对照比较,或用薄层扫描仪扫 描,用于药物或其他化合物的分离,鉴别, 检查或含量测定等。 ? TLC是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特 别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变 化的物质的分离。 ? 薄层色谱不需要特殊设备,操作简单,试样 和展开剂用量少,展开速度快。 ? TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测 柱色谱过程 。 ? 在进行化学反应时,可利用薄层色谱观察原 料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。 概 述 一、发展历史 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种 天然药物。 1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书,促 进了这一技术的发展。 因TLC法设备简单,分析速度快,分离效率高, 结果直观,很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代 以后发展了薄层色谱光密度扫描仪,各步操 作实现了仪器化,并实现了计算机化。 ? 二、特点:(薄层色谱与高效液相色谱的差 别) 1.固定相和流动相 ? TLC——流动相流动靠毛细作用力,流动相 选择较少受限制,固定相不用再生。 ? HPLC是在封闭的系统内,流动相流量靠泵 控制,溶剂选择受检测器限制,固定相需再 生。 2.样品处理 ? TLC要求没有HPLC严格。 3.色谱分离 ? TLC可同时分离多个样品,并可采用相同或不 同溶剂进行同向或双向多次展开,通常采用正 相色谱,色谱后衍生化方便。 ? HPLC一次只能分离一个样品,通常采用反相 色谱,色谱后衍生化受限制。 4.对污染物抗受力 ? TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附 物质均无影响。 ? HPLC—— 颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸 附物质均有大的影响。 薄层色谱参数 – 一、保留参数 – 1. Rf值 ? 用来表征斑点位置的基本参数是比移值,用Rf表示。 ? Rf=Ls/L0 L0 Lr 样品 W R S 原 点 参 比 前 沿 原 点 Ls – 注意: – 同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。 – 在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值 (Rf)n=1-(1-Rf)n ? 2. 相对比移值(Rx) – 在难以确定溶剂前沿的位置时,需要引入相对比移值 (Rx) Rx=Ls/Lr – 二、分离效能参数 ? 1.理论塔板数 ? n=16[Ls/W] 2 ,考虑静态扩散对起始斑点半 峰宽的影响引入真实塔板数(n真实 ) ? n线为样品斑点半峰宽, b0样品起始斑点半峰 宽 ? 塔板高度h真实= Ls/ n线.容量因子(k) – k=ts/ tm(物质在两相中滞留时间之比) – 又k=K(Vs/ Vm) – Rf=Vm/(Vm+KVs)=1/(1+k) –k ∞ 9 4 2 1 0.5 0 – Rf 0 0.1 0.2 0.33 0.5 0.67 1 – 3.分离度 – R= 2(Ls.2-Ls.1) W1+W2 – 因Ls=Rf L0,同时对相邻的两个斑点,假定 W1=W2=W – 则R= L0 Rf.2- Rf.1 W = L0 W ×⊿Rf – 与n=16[Ls/W] 2式合并,得: ? Rf与R之间存在着如图所示关系: R 1.00 Rf=0.3,R最高 Rf在0.2-0.5,R变化不大 0.75 0.5 0.25 0 0.1 Rf 0.3 0.5 Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降 0.7 0.9 1 流动相与固定相 ? 液-固吸附 ——在该色谱中,溶质的保留 和分离选择性决定于三个因素: 流动相 竞争 溶 解 能 力 吸附 剂 溶质 相互作用 固定相 要求:纯度高,含杂质少; 粒度,结构均匀一致,有一定的比表 面 积; 在展开剂中不溶; 与展开剂和式样组分不发生化学反应; 具有适当的吸附能力; 机械强度和稳定性。 选择:分离亲脂性化合物,选择氧化铝,硅 胶,乙酰化纤维素以及聚酰胺 分离亲水性化合物,选择纤维素和离 子交换纤维素及硅藻土。 一般,被分离组的极性强,选择吸附 能力弱的吸附剂;反之,选吸附能力较强 者。 种类: ? 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 ? 氧化铝—有碱性、中性、酸性 ? 硅藻土—为化学中性吸附剂 ? 纤维素—天然多糖类 ? 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料,对能形 成氢键的物质有特别的选择性 ? 硅胶:化学分子式为mSiO2· nH2O,多孔性 微粒,表面带有硅醇基,呈弱酸性。 常用硅胶规格: –硅胶H,不含黏合剂 –硅胶G,含煅石膏(硫酸钙) –硅胶S,用5%淀粉作黏合剂 –硅胶,用羧甲基纤维素(CMC)作黏合剂 –硅胶GF254,含煅石膏和一种无机荧光剂, 即锰激活的硅酸锌,在254nm紫外光下呈强 烈黄绿色荧光背景。 ? 氧化铝 碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合 物,如生物碱、脂溶性维生素等; 中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳 定的化合物; 酸性氧化铝(pH4.0)——酸性化合物的分离。 活度也与含水量有关。 流动相(展开剂) 要求:待测组分很好地溶解不与组分发生 化学反应; 组分斑点圆而集中,无拖尾现象; 注意 Rf的选择。 ? 选择:“相似相溶”原则 同吸附柱色谱 极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序: 水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇 >丙酮>乙酸乙酯>>氯仿>二氯甲 烷>甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳环己 烷石油醚。 ? 展开剂 选择原则:根据被分 离物质的极性 Stahl简图:极性物 质—活度低(活性 级大)的吸附剂-极性展开剂 ? 展开剂 ? 先用单一溶剂展开, ? 若Rf值太小, ? 则加入一定量极性强的溶剂,如乙醇、丙酮等, ? 如果Rf值太大, ? 则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等), 以降低极性。 可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。 ? 流动相选择时需考虑溶剂的下列情况 – 一些溶剂如氯仿、一般含有微量乙醇作保护剂, 有时需重蒸除去乙醇。 – 许多溶剂有吸湿性,使溶剂含水量不一致,导致实 验难以重现。 – 溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响,应注意出厂 日期。 – 混合流动相组分之间(或杂质)可能发生相互作用。 – 对于易挥发的溶剂,难于配制稳定组成的流动相。 要求操作格外小心,同时混合流动相不应重复使用。 ? 溶剂的选择性 – 指溶剂引起两种溶质位移差别的能力,即分离 度。 – R=1/4(? -1) n [?k /( ?k +1)] – 分离因子?= k1/k2,k为k1和k2的平均值 – 由上式可见,R取决于三个因子: ? 理论塔片n主要是吸附剂性质的函数 ? ?k 反映了两种溶质的平均迁移速度,其由流动相溶 剂强度?? 决定 ? ?取决于吸附剂和流动相的组成 ? 溶剂优化规则: ? 增加溶剂强度,使Rf值增大,但也可能降低分 离能力。 ? 流动相中较强组分的体积比小于5%或大于 50%,选择性最大,此时最有利于溶质与流动 相组分的选择性相互作用。 ? 用或甲醇代替流动相中的一种较强组分, 由于形成氢键可改善选择性。 ? 若出现斑点拖尾,可向流动相中加少量水,或 降低薄层活性,有利于改善分离。 ? 也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元 混合流动相,此时,溶剂强度由弱溶剂控制, 而溶剂选择性则由两强溶剂控制。 ? 斑点的扩散与形状 在TLC中斑点的移动与扩散是二维的,因为 斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速 度是不相等的,展开剂的移动速度也是不等 的,在单位体积或单位质量薄层内所含的溶 剂量越接近溶剂前沿减少得越明显,直至溶 剂前沿时为零,这一现象称为“溶剂的体积 梯度”,在各种展开形式中均存在。当然, 对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时 才需要考虑。 ? 同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他 成分的影响,这种影响的大小取决于混合成分 的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影 响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后 面的一个展开速度较其单独展开时为大。 ? 固定相的活度及其调节 在其他因素一定时,活度增加,Rf值减少, 反之亦然。可通过预吸附溶剂分子,调节其 表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿 度恒定的空间里来达到调节活度的目的。 ? 实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一 或混合溶剂蒸气,预吸附量越大,溶剂前沿 运动速度越快,物质斑点的Rf值越小。 ? 预吸附还可能影响Rf在0.6-1.0之间的斑点的 分离。 ? 在层析过程中发生的边缘效应就是由于这种 因素引起的。尤其是使用混合溶剂时,极性 较弱和沸点较低的溶剂,在薄层边缘容易挥 发,使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例 增大,Rf相对增大。同一物质在同一薄层板 上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小,即 边缘效应,若在展开前先将展开槽与薄层板 用展开剂蒸气饱和后再展开,边缘效应可消 失。采用双槽层析缸尤为有利。 预吸附中 展开中 展开过程中用 不同于展开剂 的溶剂调节槽 内气氛 薄层色谱操作 薄层板制备 ? 载板—— 5cm×20cm、10cm×20cm、 20×20cm的2mm厚的玻璃板 ? 放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时,除 去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净, 干燥,置干燥器中备用。 ? 要求光滑、平整、洗净后不附水珠。 ? 薄层板涂铺要求:均匀、平整、无气泡引起 的凹坑和裂纹。例: – 硅胶板(粒度10 ~40um) ? 硅胶G——将硅胶置研钵中,加入少量水,研 磨均匀,至无结块和气泡,再加入比例量的水 (一般为1份固定相与3份水),迅速研磨均匀, 立即涂铺。 ? 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制 0.3% ~ 0.8%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的 纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。 ? 薄层板活化 – 涂布后的薄层先在室温下阴干,在使用前 置适当温度烘烤一定时间进行活化,然后 置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有 不同,如: ? 硅胶 ? 氧化铝 110℃ 110℃ 0.5- 1h 30min ? 点样(关键点) – 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非 极性,否则易使斑点扩展。 – 采用多次点加法,第二次点加时应待前一次 点加的溶剂挥发后再进行。 – 点样量应适中,过载会引起斑点拖尾,分离 度变差,以最小检测量的几倍~几十倍为宜。 – 手工点样工具:定容玻璃毛细管(1 –5ul), 微量注射器。 展开 ? 展开方式:上行展开 ? 展开过程: ? 展开缸预先用展开剂饱和,平衡系统, 薄层板浸入展开剂展开(距边缘0.51cm),挥干展开剂 ? 检测 – 物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭 – 化学方法——加化学试剂显色,要求显色稳定、 持久、专属、灵敏。 定性、定量方法 ? 定性方法 – 利用保留值 ? 测定Rf值 ? 测定相对Rf值,即Rx值。 ? 利用二维色谱(改变色谱条件,比较Rf值是否一 致) b2 b2 b2 b1 点样 s s 第二次展开 b1 s b1 第一次展开 – 通过板上化学反应 ? 反应后生成特征颜色的化合物 ? 反应后生成复杂的混合物,根据生成物的“指纹” 特征加以鉴定。 ? 可用于定性的板上反应有:乙酰化、浓硫酸脱水、 偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还 原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方 法施加反应试剂。 – 通过板上光谱图定性 ? 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光 谱图,与平行点加的标准斑点的图谱对照。 ? 可建立标准条件下的化合物的光谱图库,用 计算机检索定性。 – 与其他技术连用 ? TLC-付里叶变换IR联用 ? TLC-MS联用 ? 定量方法 – 间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗 脱下来,再对洗脱液定量。 ? 分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法 – 直接定量 ? 斑点面积测量——用透明纸覆盖在薄层表面, 描出斑点界限,然后测量其面积。 ? 目测法——比较系列标准与样品的斑点面积 大小、颜色深浅,得到样品的含量范围。 – 薄层仪扫描定量 ? 定量计算 – 归一化法、内标法、外标法 ? 方法认证 – 选择性——以分离度表示,当待测组分的Rf 值在0.3 – 0.7之间,扫描峰拖尾因子在0.9 – 1.1之间时可以接受的分离度为R大于等于 1.0 – 稳定性——考察在采样、样品预处理、贮存、 展开,展开后处理等过程中的样品稳定性。 – 线性与范围——相应于待测组分检出量的 20% - 120%范围。 – 灵敏度——通常以标准曲线的斜率表示。 – 精密度 ? 重复性——当待测组分的含量达0.5ug/斑点 时, 方法的重复性(RSD)应在3.0%以内。 ? 中间精密度——多数情况下,RSD应在 5.0%以内。 ? 再现性——RSD一般应在10%以内。 – 检测限 – 定量限 – 准确度 高效薄层色谱法(HPTLC) HPTLC是应用高效薄层板与薄层扫描仪相结 合的方法,它是在普通TLC基础上发展起 来的一种更为灵敏、高效、快速、精密、 准确的色谱分析技术。 高效薄层板 ? 一般是使用粒度5~7μm的吸附剂,多用高 聚物如聚丙烯酸等为粘合剂,薄层厚度一 般为0.2㎜, 它比普通包层板分离度好、灵敏度高、速 度快。 薄层性能 ? 吸附颗粒小,流动相展开速率慢,容易达 到平衡,分离效率和测定精度高。 ? 影响因素:吸附剂的粒度、分子扩散系数、 展开距离和分离组分的Rf等。 点样与展开 ? 展开后所形成的斑点越小而圆,分离效果 越好。HPTLC是采用自动点样,可调节原 点的大小、能控制点样次数、点样间距、 点样容器与薄层接触的时间。 ? 展开方式与TLC无甚区别。分为直线展开 或径向展开。 薄层扫描 ? 原理 ? 薄层定量方法可分为 – 直接法——测定照射光照射色谱后,因被测物斑点 的存在引起的透射光和反射光的变化。并通过随行 标准比较待测斑点的量。 – 间接法——将部分照射光的能量转换成较长波长的 荧光,即荧光测量。 – 薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄 层空白处光学响应信号的差值。 ? 一强度为I的光照射薄层时,被照射的一面为 “近表面”,另一面为“远表面”。 漫反射 光(I) 近表面 (表面粗糙) 镜反射或表 面反射Is(表 面平滑) 返回光强(IR ) 入射强度I0 出射强度(IT ) IT / I0为薄层 透射率AT 远表面 I0 -( IR + IT )=差 为被介质吸收并转 换为热的光强 IR / I0为介 质 的漫反射率 AR ? 光学系统 ? 薄层色谱扫描仪光学系统有三种 – 单光束单波长——受光源稳定性和薄层质量影响严 重。 – 单光束双波长——对背景不均匀引起的干扰有补偿 作用,选择的两个波长应接近些。 – 双光束单波长——可补偿光源不稳引起的误差,但 对板层不均匀无作用。 光 光 检测器 单色器 波长1 检测器 斩波器 光 波长2 检测器 单色器 分 光 镜 检测器 ? 透射光法 – 测定组分对应的斑点对 特定波长光的吸收度来 确定含量。将薄层板从 左至右移动,对斑点扫 描,单色光透过薄层板 后被记录下来,将测得 的吸收度对Rf值绘制扫 描曲线,得薄层色谱图 单色器 光源 ? 反射光法 – 一定波长的光照射薄层, 穿进薄层内的光部分被 薄层吸收,部分经过漫 反射又折回表面成为反 射光。当对薄层进行扫 描时,测量其反射吸收 度,可得到反射光谱。 反射吸收度与物质含量 有确定关系,可进行定 量。 光源 单色器 ? 扫描方式 – 直线式扫描——照射在 薄层板上的光束与薄层 板作直线相对运动。光 束固定,扫描板台运动。 光束落在薄层上的截面 为一长方形带。 – 锯齿式扫描——照射在 薄层板上的光束与薄层 板的相对运动轨迹呈锯 齿形或矩形。 直线扫描 锯齿扫描 轮廓曲线 积分曲线 A B A B C C A B C 对于不规则斑点,两种扫描结果不一样。同一斑 点从A、B、C三个不同方向扫描,锯齿扫描所 得积分值变动小,而直线扫描所得积分值变动大。 ? 测量方式 – 吸光度测量——测定的是漫反射光。适合于本身有 颜色或有紫外吸收的物质。 检 I0 测 器 IR – 荧光测量——灵敏度较吸光度测量高,板层不吸收发 射光,测量噪音小,基线稳定。为消除激发光的影响, 在板层和检测器之间必须加一块滤光片,以截去反射 激发光,只让发射的荧光抵达检测器。 检 测 器 荧光 滤光片 ? 荧光淬灭测量——吸附剂有荧光,样品斑点无荧 光,在紫外光照射下,被测物在荧光背景上显示 出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色,又无特征 紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式: 测荧光 测紫外光 测紫外和荧光 ? 扫描仪 – 机械扫描仪——可进行吸光度和荧光测量,以 反射测量方式为主,也有能提供透射测量方式 的(主要用于电泳谱图扫描测量)。 – 高速扫描系统——可分为两类 ? 光栅扫描系统 ? 位敏扫描系统 ? 这类扫描仪技术上一些问题还未解决。 ? 扫描定量中的标准曲线校正 – 薄层板上由于光被吸附剂散射,不能得到象 通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单 直线关系。即物质浓度越大,薄层试样板上 测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。 扫描仪系统设计时考虑到这一问题,采用微 机处理使标准曲线个点,将各吸光度值 转换为直线上的值,得到一条通过原点的直 线 经变换后 的直线 积 分 值 理论曲线 校正过度 校正适当 校正不足 未校正 0 物质量 直线化方法示意图 试样量 校正情况判断 ? 使用直线化功能时的注意事项 – 发色试样的测定——对于没有吸收的试样进行发色测定 时,一般不使用直线化功能就可以得到近似的直线关系。 – 试样变质时——试样展开后,应马上进行测定,如果放 置一星期后再测定。即使近似地呈直线状也往往不能通 过原点,认为是试样变质所引起的。 – 展开距离——同一试样等量点样,同样展开,展开距离 不同将引起误差。 – 展开方法——使用直线化功能定量时,为避免展开距离 不同产生的误差,实际定量时,将已知浓度的标准品在 同一块板上展开是较理想的。 应用 ? 药物鉴别——采用标准对照法 ? 杂质检查 – 杂质对照品法 – 高低浓度法 – 药物标准品对照法 –不允许有杂质斑点存在,即以方法灵敏度来控制杂 质量。 ? 含量测定——主要用于中药有效成分的分析


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