薄层色谱法_图

发布者:admin 发布时间:2019-10-27 13:34 浏览次数:

  薄层色谱法_化学_自然科学_专业资料。 l 定义:薄层色谱法,或称薄层层析(thin—layer chromatography),系将适宜的固定相涂布于玻 璃板、塑料或铝基片上,成一均匀的薄层;将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端,

  l 定义:薄层色谱法,或称薄层层析(thin—layer chromatography),系将适宜的固定相涂布于玻 璃板、塑料或铝基片上,成一均匀的薄层;将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端,在展开 容器内用适宜的溶剂(展开剂)展开,使供试品 中所含成分分离,采用适合的显色剂或显色方法 显色,将供试品色谱与对照物色谱比较,或采用 薄层扫描仪扫描,以进行鉴别、检查,或含量测 定的方法。 l 特点:高效、快捷、方便、直观、经济。 l 分型: ü 薄层吸附层析(吸附剂) ü 薄层分层层析(纤维素) ü 薄层离子交换层析(离子交换剂) ü 薄层凝胶层析(分子筛凝胶) ? 一般中药分析中应用较多的是以吸附剂为固定相的 薄层吸附层析 ?薄层吸附层析法: 它是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不 同,使在移动相(展开剂)流过固定相(吸附 剂)的过程中,连续的产生吸附、解吸附、再 吸附、再解吸附,从而达到各成分的互相分离 的目的。 三、仪器和器材 ? 薄层板 ? 点样器 ? 展开缸 ? 显色装置 ? 检视装置 ? 扫描仪 ? 薄层板 1、吸附材料不同分为:硅胶板薄层板、聚酰胺薄层 板 硅胶薄层板是目前应用最广泛的薄层板,最常用的 固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254 2、薄层板涂布的背材不同分为:玻璃板、铝箔板、 聚酰胺薄膜板 3、吸附材料的粒径分为:普通板与高效板 高效薄层板(HPTCL)所使用的固定相较普通薄层 板平均粒度小,颗粒分布范围窄,因此在相对短的 展开距离中可以达到更好的分离效果。 传统薄层板与高效薄层板的比较 平均粒度(um) 颗粒分布(um) 点样量(ul) 展距(cm) 分离时间(min) 检测限:可见光(ng) 荧光(ng) 薄层厚度(mm) TCL 10-40 宽 大 10-15 30-200 100-1000 1-100 0.2-0.3 HPTCL 5-10 窄 小 5-8 3-20 10-100 0.1-10 0.1-0.2 4、按来源分为: ? 市售薄层板 青岛海洋化工(玻璃) 天津斯利达(铝箔) 进口薄层板(Merck等) ? 不同品牌的薄层板,所用的硅胶 粒度、粘合剂不同,薄层行为和薄层 色谱效果存在差异,因此实验时必须明确品牌。 ? 自制薄层板 在保证色谱质量的前提下,如需对薄层板进行特别处理 和化学改性,以适应供试品分离的要求时,也可用实验室自制 的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅 胶HF254、微晶纤维素等,其颗粒大小,一般要求粒径为10~ 40μm。 (自制薄层板由于操作粗放,硅胶质量不高和手工操作个体差 异大致使色谱质量不高,分离度、重现性均难以达到满意效果,所 以一般只针对需特别处理和化学改性的薄层板。) l点样器: 一般采用微升毛细管(定量点样毛细管: 0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等)、微升注射 器或半自动、全自动点样器材,手动点样时建议 采用微量毛细管。 l展开缸 应用适合薄层板大 小的薄层色谱专用展开 缸(箱),展开缸有水 平式和直立式两种类型。 日常用的最多的是直立 式展开缸。它又分平底 展开缸或双槽展开缸。 双槽展开缸具有节省溶 剂、便于预平衡、可控 制展开缸内相对湿度等 有点,故此常推荐使用。 水平展开用专用的水平 展开缸。 l显色装置 薄层色谱法可针对不同的样品采用不同的显色 方法和显色剂进行显色,从而可以专门针对某一 化合物进行检视,或对紫外光和可见光下无吸收 的化合物进行检视。极大的提高了薄层检视的专 属性与灵敏性。这是薄层色谱法灵活性的一个集 中体现。即同一薄层板可生成可见光、紫外光谱、 荧光光谱和荧光淬灭光谱。 主要的显色方法有:喷雾显色、浸渍显色与蒸 气熏蒸显色。 三氯化铝:黄酮类专属显色剂 碘化铋钾:生物碱专属显色剂 硫酸:许多成分激发荧光的通用试剂 喷雾显色应:使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾 器,要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷 出。 ? 浸渍显色:使用浸渍槽也可用适宜的展开 缸代用,使用时,将展开的薄层板平稳垂直的 放入浸渍槽中一至数秒后取出,擦去薄层扳背 面残存的试剂,显色后的图像供分析用(需要 时可以加热)。 ? 蒸气熏蒸显色:可用双 槽展开缸或适宜大小的干燥 器代替,如碘蒸汽。 ? l检视装置 为装有可见光、 254nm(荧光萃灭)及 365nm紫外光光源及相 应的滤光片的暗箱, 可附加摄像设备供拍 摄图像用,暗箱内光 源应有足够的光照度。 l薄层色谱扫描仪 系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点, 或经激发后能发射出荧光的斑点,进行扫描,将 扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量 的分析仪器。 四、点样操作 l 点样前薄层板准备 ?薄层板表面应均匀、平整、光滑,无麻点、无气 泡、无破损及污染。铝基片薄层板可根据需要剪 裁,但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得 有破损。 ?临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不 需活化。 ?如在存放期间被空气中杂质污染,使用前可用异 丙醇、二氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂(8:2) 在展开缸中上行展开预洗,取出,晾干,110℃活 化,置干燥器中备用。(注意标记方向) ?如需对薄层板进行化学改性,可浸入改性剂溶液 中数秒,取出,晾干,活化后备用。 l点样 除另有规定外,在洁净干燥的环境,按规定用微升毛细 管分别吸取供试品溶液或对照品溶液,以垂直方向小心接 触薄层表面做点状点样或条带状点样(或符合要求手动、半 自动、自动点样工具点样,条带状点样最好用专用的半自 动、自动点样仪)。操作时要细致小心,注意勿损伤薄层 表面,条带状点样要注意条带的均匀;原点尽量减少溶剂 扩散现象,特别是点样量较大时要更要注意。 《中国药典》2015版一部点样要求 TLC 距底mm 点间距mm 点直径mm 条带长mm 展距cm 10~15 以互不干扰为宜 8 ≤4 5 ~10 8-15 HPTLC 8 ~10 以互不干扰为宜 5 ≤2 4~8 5 5-8 展开剂与原点间距mm 5 以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点 样两种 ?接触式点样 将吸有样品溶液的毛细管或针头与 薄层板表面接触,从而使样品在薄层板上形成圆 点状的点。多采用毛细管微量注射器手动点样, 有的仪器也可以进行接触式点样。 ?喷雾点样 点样针针杆匀速向下推,针头部形成 小液滴被喷头喷出的气流垂落在薄层板上,机械 推动薄层板匀速摆动,则形成均匀的条状原点。 必须采用仪器进行。 喷雾点样的优点:1、点样过程中,点样器不与薄层板接 触,防止薄层板物理损伤;2样品密集,有利于展开后检视; 3、减少样品扩散,样品斑点窄,展开后分离度提高;4、 自动化程度高,样品溶液不易在针壁上残留。 五、展开 将点样后的薄层板放入加有展开剂的展缸中,密闭, 展开,薄层板浸入展开剂的深度一般要求溶剂的液面距原 点约5mm,密闭展开,展开至规定规定的展距后,立即取 出薄层板,晾干,以备检测。多数品种展距为7~9cm,必 要时可用长度为15或20cm的板,展距可适当延长至12 ~ 14cm。高效薄层板上展开5~8cm。 ? 薄层板展开方式主要有:上行展开、下行展开、水平展开 和环形展开,必要时也可进行二次展开或双向展开。 ?展开前如需溶剂蒸气预平衡,可在展开缸中加入 适量的展开剂,密闭,保持15~30分钟,待溶剂蒸 气平衡后,应迅速放入点有样品的薄层板,立即 密闭,展开。 如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态,则 须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的 滤纸,密闭一定时间,使达到饱和再如法展开。 ?展开用的溶剂需要使用分析纯并要求临用前配制, 不可多次反复使用。展开剂如需分层,则放置分 层后按要求分取上层或下层,备用。 六、显色与检测 色谱斑点本身有颜色者,可直接在日光下观察可见光谱;斑点在 紫外光激发下可以发射荧光者,可直接在365nm紫外灯下观察荧光色 谱;对于可见光下无色,但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂 的硅胶板(如硅胶GF254板),在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的 荧光猝灭物质形成的色谱。 需要加试剂方能显色或发射荧光者,需要将试剂均匀喷洒于薄层 板面,直接观察或加热显色后观察。 用浸渍法,具有板面显色均匀的特点,但有的样品经试剂浸渍后, 斑点容易被浸润而扩散或拖尾。 加热显色需注意加热时间和温度,如含羟甲基纤维素钠的手工自 制薄层板代替预制板,注意加热温度过高或加热时间过长,容易引起 板面焦化,如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果, 需要特别注意。有的成分加试剂(如挥发油或甾醇类经香草醛硫酸、 硫酸醋酐等)显色后,加热温度高低和时间长短不同或放置时间不同, 斑点的显色可能随时间而有所改变。 有的品种可以熏以试剂或试液的蒸气(如碘蒸气、氨蒸气)显色。 七、记录 薄层色谱图像一般 可采用摄像设备拍摄, 以光学照片或电子图像 的形式保存。也可用薄 层扫描仪扫描记录相应 的色谱图。(在紫外光 下拍摄时,应使用适宜 的滤光片滤除紫外光。) 八、系统适用性试验 按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试 验,即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整, 应达到规定的检测灵敏度、分离度、重复性和比移值 要求。 ? 检测灵敏度 用于限量检查时,采用供试品溶液和对照品溶液与 稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下,于同一薄层板 上点样、展开、检视,后者应显清晰的斑点。 ? 分离度 用于鉴别时,对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑 点,应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时, 要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度,分离度(R)的计 算公式为:R=2(d2-d1)/(W1+W2) 式中:d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离; d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离; W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。 除另有规定外,分离度应大于1.0。 ? 重复性 同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成 分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%;需显色 后测定的相对标准偏差应不大于5.0%。 ? 比移值 系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开 剂前沿的距离的比值。 计算: 比移值(Rf)=从基线至展开斑点中心的距离/从基线 至展开剂前沿的距离 鉴别时可用供试品的主板点与 对照品溶液主板点的比移值进 行比较,或用比移值来说明主 斑点或杂质斑点的位置,除另 有规定外,比移值(Rf)应在 0.2-0.8之间(含量测定时比移 值(Rf)应在0.3-0.7之间)。 九、测定法 ? 鉴别 取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液,在同一薄 层板上点样、展开与检视,供试品溶液所显主斑点的 颜色(或荧光)和位置应与对照溶液的斑点一致。 ? 限度检查 采用定量配制的对照品对照或对照品稀释 对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的 对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较,颜 色(或荧光)不得更深;或照薄层色谱扫描法操作, 峰面积不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定 检查的斑点数和限量值。 ? 含量测定 照薄层色谱扫描法,测定供试品中相应成分 的含量。 十、影响因素 1、样品预处理与供试品溶液的制备 由于中药的成分复杂,未知成分多,供试品溶液 中溶出的物质较多,其中既有待测成分也有“其它杂 质”,常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意 的分离效果,甚至难以辨认。所以许多情况下为了得 到一个较为清晰的色谱,样品提取物经预处理,使供 试品溶液得到净化,往往是一个主要的甚至是关键的 步骤。 供试品溶液提取净化常用方法:单一溶剂提取法、分 段提取法、液-液萃取法、固-液萃取法等 ? 2、薄层色谱点样技术 点样是薄层色谱分析的第一步,也是非常关键的一 步。它既关系到能否得到可以重现的良好分离度的薄层 色谱,也关系到定量测定结果的准确度,因而不良的点 样是最主要的误差来源。 点样容积(原点直径):薄层板的原点位置对 样品的负荷量是极为有限的,如果点样量过大 将明显降低分离效率。 ? 点样环形色谱效应:如果样品在溶剂中的溶解 度过大,点样原点将变成空心圈,会对随后的 线性展开造成极不利的影响。 ? 供试品溶液溶剂残留:若供试品溶液溶剂残留, 会改变展开的选择性,特别是供试品溶液的溶剂 极性与展开的溶剂极性相差较大时更为明显;再 者,亲水溶剂残留在原点吸收大气中的水分(特 别是高湿环境)对色谱质量的影响也不可低估。 ? 薄层表面的的机械损伤:点样对薄层表面的的机 械损伤,对色谱质量尤其是定量分析将带来灾难 性的影响。 ? 点样时间:在薄层点样时,点样时间不宜太长, 要求控制在10min以内; ? 相对湿度:在薄层点样时,要求在洁净干燥的环 境内点样,一般要求相对湿度控制在65%以下。 ? 3、吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响 ? 吸附剂的活性:吸附剂的活性是由表面能与表 面积决定的,表面能越大吸附力越大,即活性 越高,反之吸附力越小,活性越低。如硅胶之 所以有活性,是由于表面含有众多的硅醇基, 硅醇基的活泼羟基和游离羟基与极性化合物或 不饱和化合物形成氢键所致。而硅醇基是亲水 基团,很容易吸附水而形成水和硅醇基从而失 去活性。所以硅胶板在使用前常常需要在 105℃-110℃活化30min。 ? 相对湿度: a、由于硅胶表面吸附水分的作用是可逆的,活化 后的薄层板可以吸附大气中的水分而降低活性,在 不同的相对湿度下可以达到不同的吸附平衡,在相 对湿度改变的情况下会重新达到新的吸附平衡。 b、有些样品所选的展开剂对相对湿度有较宽的适 应能力,即对相对湿度的要求不甚严格,大致相对 湿度在30%~70%下可以得到相对稳定的色谱;但 另外有些样品所选的展开剂对相对湿度要求非常严 格,只有在相对湿度恰好合适的情况下才能把试验 做好,因此,此类试验应在相对湿度控的条件下展 开为宜。 c、相对湿度的控制:可在双槽展缸的一侧或预先 准备好的控制箱中加入一定量适当浓度的硫酸,将 薄层板放在另一侧15 ~ 30min;然后在另一侧倒入 展开剂展开。 表:控制不同相对湿度所需浓 硫酸溶液 相对湿度 所需硫酸浓度(v/v) 硫酸(ml) 18% 32% 42% 47% 58% 65% 72% 88% 100 68 57 50 39.5 34 27.5 10.8 水(ml) 95.5 100 100 100 100 100 100 100 4、溶剂蒸气的饱和度 吸附剂表面的空间是 很有限的,当多种溶剂展 开时,不同溶剂分子在吸 附区相互竞争,发生“取 代效应”,尤其在薄层板 的下部更为严重。由于这 种影响极为复杂,若不加 以控制很难得到稳定的色 谱。 ? 溶剂预饱和是减少边缘效 应最有效方法。 5、色谱的优化及溶剂系统(展开剂)的选择 固定相的极性(正相或反相),展开剂的种类(溶剂的极性和选择 性)、极性大小或酸碱性,以及展开方式都会对色谱造成较大的影响。 展开剂配置 ? 展开用的溶剂需要使用分析纯并要求临用前配制,不可多次 反复使用。展开剂如需分层,则放置分层后按要求分取上层 或下层,备用。(溶剂所含杂质、水分、或吸收空气中干扰 气体均会影响分离效果,如甲酸乙酯遇水水解、多次开瓶残 存溶剂吸收了大气中的水分等) ? 取液体积1ml,使用微量移液器; ? 1ml≤以液体积≤20ml,使用移液管; ? 取液体积20ml,使用量筒; ? 为减少误差,可以一次性准备足够一天使用的展开剂的 量; ? 保存于具塞容器中,确保混合均匀。 6、温度对薄层色谱的影响 首先,温度的变化会影响展开 剂各有机溶剂因沸点、蒸汽压、蒸 发数目、相对密度等不同而蒸发程 度各异,因而造成展开缸内各有机 溶剂蒸气的比例发生变化,最终影 响到带分离物质的色谱行为。 其次,由于温度的变化,含水 两相展开剂在放置分层过程中或展 开时有机相中水的比例不同,从而 改变了展开剂的极性,影响到色谱 的分离。 另外,温度的变化还会对Rf造 成影响。一般温度越高Rf值越大 7、薄层板对薄层色谱的影响 由于不同厂家生产的薄层板所用的硅胶的粒度、性质以及 黏合剂均有所不同,其色谱行为和重现性也存在一定差异。 十一、常见问题 1、薄层色谱背景干扰大 原因:样品前处理除杂不够。 2、Rf值过大或过小( Rf一般在0.2~0.8,定量测定在0.3~ 0.7之间) 原因:展开剂的极性过大或过小。 3、多前缘效应 原因:由于展开剂中溶剂沸点不一致,展开时蒸发的速率 不一致(特别是含甲酸、冰醋酸),展开后薄层板上会出 现双前缘或多前缘。 (解决办法:控制展开时温度,不宜过高或过低,建议在 室温下进行。) 4、边缘效应(边缘效应是指样品在展开时,薄层板 两边的斑点比中间的斑点移动快,并向两边偏斜) 原因:混合展开剂展开过程中,其极性较弱和沸 点较低的溶剂在薄层板两边沿处较易挥发,使薄 层板上展开剂的比例不一致,极性发生变化,重 现边缘效应(多发生在三氯甲烷-甲醇系统)。 (解决办法:增加展开缸内溶剂蒸气浓度,可在 展缸内壁贴上浸润展开剂的滤纸;选择公沸试剂 代替一般混合试剂。) 5、拖尾现象(最常见) 原因:点样过量,薄层板超载;重复点样圆心未 重合;薄层板、展开剂选择不合理。 十二、注意事项 1、薄层板的活化与保存 自制薄层板和商品薄层板在 使用前均应进行活化,活化后的薄层板应立即放 置于有干燥剂的干燥器中保存。保存时间不宜过 长,最好随用随制,放入干燥箱中保存近作为使 用前的一种过渡。 2、供试液的制备 溶剂选择是否适当影响点样原点 及分离后斑点的形状,一般应选择极性小的溶剂; 只有在供试品极性较大,薄层板活性较大时,才 选择极性较大的溶剂。除特殊情况外,试液的浓 度药适宜,最好控制在使用点样量不超过10ul(高 效薄层板不超过5ul)。 ? 3、点样 薄层板上供试品溶剂的负荷量极为有限, 普通薄层板的点样量最好在10ul以下,高效薄层板 在5ul以下。点样量过多可造成“超载,展开剂产生 绕行现象,使斑点拖尾.点样速度要快,在空气中点样 以不超过10min为宜,以减少薄层板与大气的平衡 时间,点样时必须注意勿损坏薄层板表面。待溶 剂挥发后方可展开。 ? 4、点样环境 实验环境的相对湿度和温度对薄层分 离效果有着较大的影响(实验室一般要求相对湿 度在65%以下为宜),因此应保持试验环境的相对 恒定。对温、湿度敏感的品种必须按品种项下的 规定,严格控制实验环境的温、湿度。 5、点样时几个样点要在一条直线上,大小要合适 (斑点直径一般不超过4mm),间距8mm。 6、点样用的毛细管不能交叉使用。 7、因溶液太稀,一次点样如果不够需重复点样,则 应待前次点样的溶剂挥发后方可重点,以防样点 过大,造成拖尾、扩散等现象,影响分离效果。 8、点样要轻,不可刺破薄层;点样结束待样点干燥 后,方可进行展开。放板时手要平稳,否则走出 斜线。


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